Jurnal SFS

Mempelajari Cara Kerja Obat Pada Sistem Imun Menggunakan Mikroskop

Carolina Camargo de Oliveira* dan Dorly de Fiertas Buchi**

*Departemento de Biologia Celular, Universidade Federal do Parana (UFPR), Brasil

**UFPR, Centro Politecnico, SCB, Dpto de Biologia Celular, Brasil

1. 1. Pendahuluan

Brasil kaya akan budaya pop dan tanaman obatnya yang digunakan untuk kesehatan dan meningkatkan fungsi tubuh. Di Brasil, penduduknya memanfaatkan beberapa tanaman untuk dibuat tonik dengan cara infusi atau dekoksi. Penggunaan yang popular adalah untuk penguat, vitalitas, dan meningkatkan stamina. Produk yang ditawarkan biasanya diolah menjadi jus atau bir. Tidak ada bagian spesifik dari tanaman yang digunakan sebagai obat, namun pada beberapa kasus seluruh bagian tumbuhan dimanfaatkan. Ekstrak miyak essensial dan etanol dari daun dan akar tanaman obat juga sering digunakan. Brasil adalah contoh negara yang memiliki keragaman flora dan kaya akan tradisi menggunakan tanaman obat untuk anti-bakteri, anti-jamur, dan penyembuhan penyakit tropis; leishmaniosis, malaria, schistosomosis, serta infeksi jamur dan bakteri. Namun, perkembangan agen fitoterapi yang menggunakan keanekaragaman hayati Brasil untuk ilmu pengetahuan belum memuaskan. Saat ini riset pada bidang ini sudah meningkat dengan hasil yang memuaskan. Penelitian ini bertujuan untuk menginvestigasi model biologi dan teknik mikroskopi yang digunakan di laboratorium  serta mengevaluasi mekanisme kerja beberapa produk obat.

1. 2. Detail Eksperimen

Eksperimen ini mengikuti The National Law (nomor 6.638,  5 November 1979) dalam penggunaan binatang dan semua praktik  telah disetujui oleh Institutional Animal Care Comittee di UFPR, eksperimen dilaksanakan di Neoplasmic and Inflammatory Research Laboratorium di UFPR yang mempunyai program manajemen limbah. Semua eksperimen dikerjakan sedikitnya 3 kali dengan 3 kontrol dan hasilnya di analisa dengan cara double blind way.

2.1  Menyiapkan kultur sel

Kultur awal diambil dari peritoneal cavities (makrofag) atau femur  (sumsum tulang belakang) pada tikus. Garis keturunan sel dibeli dari agen khusus. Sel dipelihara di kultur, diinkubasi dengan suhu 37 °C dibawah 5%  dengan Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) ditambahkan 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 50 μg/ml penisilin and 100 U/ml gentamisin, dan dilakukan sesuai dengan prosedur yang disyaratkan.

2.2  Mikroskop Cahaya

Sel ditempatkan di kultur padat dengan cover clip, diberi perlakuan sesuai dengan protokol spesifik, lalu dicuci dengan format buffer solution (PBS) diolah di Bouin lalu pewarnaan dengan Giemsa dehydrated lalu ditambahkan dengan Entellan. Sel yang telah diberi perlakuan lalu diamati dengan mikroskop cahaya Nikon Eclipse E200. Morfologi karakter dan setiap sel dianalisa. Untuk setiap cover clips terdapat 100 sel dari total plat sel dan data yang didapatkan di proses dengan analisa statistik.

2.3  Transmission Electron Microscopy

Setelah percobaan diatas, sel dicampur dengan 2% glutaraldehid, 4% paraformaldehid, 5mM CaCl di O.1 cacodyte buffer  (pH 7,2) sebelumnya dicampur di 1% osmium tertroxid (Oso4) didehidrasi di aseton dan dicampur di Epon (2-3). Bagian yang ultratipis diberi warna dengan sitrat dan uranil asetat dan diamati dengan JEOL-JEM 1200 EX II TEM di Electron Microscopy Center of UFPR. GATAN CCD kamera dan GATAN digital micrograph software digunakan untuk menghasilkan gambar digital.

2.4  SEM

Sel dicampur dengan 2,5 % glutaraldehid ( 0,1 M CaCo dilate buffer, Ph 7,2), dicuci dan post-fixed di 1 % 0,04 selama 30 menit di ruang gelap pada suhu kamar. Setelah dicuci, sel dihidrasi dengan etanol tinggi konsentrasi . Sel berada dalam titik kritis  terdehidrasi, dan diobservasi menggunakan JEOL JSM-6360 LV SEM electron microscopy center di UFPR.

2.5  TEM

Immunostaining dilakukan sesuai dengan standar protocol dengan antibodi komersial untuk penanda permukaan. Sel ditempatkan di es diblok dengan 1 % PBS/DSA (bouin serum albumin), dan diinkubasi dengan 1 μg biotinylated antibodi di 1% PBS/DSA selama 40 menit. Setelah dicuci, lalu dicampur di 2 % paraformaldehid selama 30 menit. Dan radikal aldehid di blok dengan 0,1 M glyane di PBS. Sel diinkubasi dengan pikoeritrin (PE) diberi label antibodi kedua lalu di tambahkan di PBS selama 40 menit. Nukleus diberi warna dengan 300nM NAPI (4,6-diamidino-2-fenilindole, dihidroksiklorida)(Molecular Probes, Eugene, OR, USA), yang ditambahkan 15 menit sebelum sel di observasi. Sel yang dicuci dengan PBS, ditambahkan dengan fluormun-6 dan fluorsens dianalisis dengan Radiance 2001 laser scanning confocal mikroskop (BIO-RAD) digabungkan dengan Eclypse E-800 (nikon).

Akridin jingga, setelah perlakuan, sel diinkubasi dengan 3 μg/ml akridin jingga solution selama 20 menit dengan suhu 37° C, 5 % CO2. Coverclip ditempatkan di PBS drop dan diamati dengan Radience 2001 laser scanning confocal mikroskop (BIO-RA) menggunakan argonium laser (488nm).

2.6  Sitometri alir

Immunophenotyping dilakukan dengan antibodi spesifik untuk setiap sel. Leukosit dilabeli menggunakan monoclonal antibodi anti-CD45. Lalu monosit/makrofag ditambahkan dengan antibodi spesifik untuk setiap sel. Leukosit dilabeli dengan menggunakan antibodi monoklonal CD45. Lalu monosit atau makrofag(CD11b), granulosit (ly-6G), limfosit B (CD45R), sel dendrit (CD11c), limfosit T (CD3), eritrosit (TER-119). Sel (1×106) diinkubasi dengan 0.5 μg/ml PE atau FITC antibodi berlabel di PBS selama 40 menit ditempat gelap. Setelah inkubasi, sel dicuci, lalu di suspensi kembali di PBS dan flourosens di analisa sesuai dengan prosedur standar pada sitometri alir FACSCalibur (Becton Dickenson-BD), dilengkapi dengan argon ion laser (488nm). Data dianalisa di Cell Quest Program (BD) dan di submit untuk mencari analysis of variance (ANOVA) dan tukey test (p<0.05) untuk menentukan signifikan statistik.

2.7  Ultrastruktur sitometri

Semua bagian ultratipis dari ultrastruktur sitokimia telah diamati tanpa pewarnaan menggunakan mikroskop transmisi elektron Jeol 1200 EXII. Alat penganalisa gambar GATAN digunakan untuk memperoleh gambar.  Teknik aktivitas asam pospat (AcPase) dan Mg++ATPase berdasarkan reaksi dihasilkannya fosfat oleh sel dengan serium klorida, yang hasilnya adalah pengendapan elektrodensitas serium fosfat. Sel diolah terlebih dahulu dengan 1% glutaraldehid dalam 0.1 M buffer cacodylate, pH 7.2, pada suhu 4°C selama 10 menit, lalu dibilas dan dicuci dalam 0.05 M buffer tris-maleat, pH 5.0. lalu sel dibilas dan prainkubasi di medium yang mengadung 2mM CeCl3, 5% sukrosa dan substrat enzim spesifik di dalam buffer yang sama. Reaksi kontrol diinkubasi di medium yang sama tapi tanpa substrat. Setelah inkubasi, sel dibilas, diolah dan diproses secara rutin. Teknik aktivitas NADPH oksidase berdasarkan reaksi dihasilkannya H2O2 oleh sel dengan serium klorida, yang hasilnya adalah pengendapan serium peroksida (Ce-[OH]2OOH). Sel dicuci dengan 0.1 M TRIS buffer maleat (pH 7.5) yang mengandung 7% sukrosa pada suhu 4°C. Setelah dicuci , sel diinkubasi selama 10 menit pada 37°C dengan buffer yang sama yang mengandung 1mM 3-amino-1,2,4 triazol-katalase inhibitor (AT), dan selanjutnya diinkubasi dengan larutan baru selama 20 menit pada suhu 37°C di 0.1 M TRIS-maleat buffer (pH 7.5) ditambahkan 7% sukrosa, 0.71 mM NADH sebagai substrat, 2mM CeCl3, sebagai agen penangkap dan 10 mM AT. Larutan digunakan sebagai enzim kontrol yang kekurangan substrat enzim. Setelah diinkubasi, sel diproses secara rutin dengan mikroskop transmisi elektron. Enzim peroksisomal sinyal katalase dan aktivitas sitokrom oksidase dideteksi berdasarkan polimerisasi oksidatif 3.30-diaminobenzidin (DAB) menjadi produk reaksi osmiofilik (pengendapan DAB). Lalu sel dibilas pada suhu 4°C dengan 1% glutaraldehid di 0.1M buffer cacodylate (pH 7.2) mengandung 5% sukrosa. Lalu sel dibilas kembali dan diinkubasi di medium reaksi yang mengandung 5mg 3,30-diaminobenzidin (DAB) dalam 0.05 M TRIS-HCl buffer (pH 7.6) dan selanjutnya diinkubasi selama 10 menit dengan 0.05 M TRIS-HCl buffer (pH 7.6). Lalu sel diproses menurut protokol mikroskop transmisi elektron seperti yang dijelaskan sebelumnya.

1. 3. Hasil dan Pembahasan

Polisakarida dari beberapa sumber telah menunjukkan adanya aktivitas anti tumor dan rendah racun dan mikroskopi elektron salah satu alat terbaik untuk investigasi ini. Polisakarida α-D-glucan dari lumut Ramalina celastri telah dipelajari terhadap sel HeLa (in vitro)dan Sarcoma 180 (in vivo). Telihat bahwa α-D-glucan sitoksik terhadap sel HeLa dengan dosis 80 μg/ml, meskipun monolayer sel serupa denagn kontrol; pada level ultrastuktur terdapat mikrovili dalam jumlah besar yang tersubstitusi oleh bleb sitoplasma, mengindikasikan adanya luka seluler. Pengobatan pada tikus dengan Sarcoma 180 mengindikasikan bahwa α-D-glucan dapat menghambat 36% dari pertumbuhan tumor dan mempengaruhi pertahanan inang dan respon sel.

Penelitian di laboratorium dengan obat homeopathic sangatlah jarang; kebanyakan merupakan laporan-laporan klinik dengan berbagai metodologi, kontroversial dan hasil yang meragukan. Meskipun demikian kebanyakan orang menggunakan sistem terapi ini. Di Eropa , homeopati merupakan therapi alternatif yang banyak diminati. Di Brasil, data pengguna homeopati tidak diketahui. Di komunitas sekolah medis 60% guru mengatakan tidak banyak mengetahui tentang terapi ini, dan 80% mengatakan kegunaan logis dari homeopati. Sejak 1997, telah ditemukan banyak hasil penting berhubungan dengan studi pengobatan homeopati yaitu Canova (CA). Manupulasi terhadap pengobatan tersebut berdasarkan teknik homeopati awal menurut Hahnemann yang menggunakan substansi yang sangat lemah dan telah terkocok dengan keras selama persiapan. Observasi klinik pada pasien menegaskan kesuksesan dari pengobatan ini dan sepertinya akan meningkatkan imunitas individu untuk merangsang respon imun untuk melawan kondisi patologi. Beberapa pasien dan dokter menghasilkan hasil yang sama: meningkatkan nafsu makan, mengurangi rasa sakit, dan kembali ke aktivitas rutin.

Obat CA adalah produk komersial baru dalam bentuk terapi immunomodulatori. Obat CA berbentuk cair, tidak berwarna dan tidak berbau yang diproduksi dan dijual di toko obat resmi Brasil. Sumber perwarna dibeli dari lembaga yang berwenang yang ditunjuk oleh Departemen Kesehatan Brasil. Badan-badan ini menjamin kualitas (endotoksin gratis) dan komposisi kimia fisik produk-produknya. Mulai dari keaslian sumber pewarna (dalam kasus tanaman ini ekstrak ethanol) beberapa dikocok secara dinamis (gemetar) dan proses dilusi pada distilasi air. Produk komersial akhir terdiri dari Aconitum napellus (Ranunculaceae), Thuya occidentalis (Cupresaceae), Arsenicum (arsenic trioxide), Lachesis (Virperidae) dan kurang dari 1% etanol dalam air suling (www.canovadobrasil.com.br). Dalam eksperimen kami menggunakan produk komersial yang dibeli dari Canova do Brasil.

Beberapa teknik mikroskopi digunakan untuk menunjukkan bahwa CA dapat mengaktifkan makrofag. Piemonte dan Buchi pada tahun 2002, menunjukkan baik in vivo dan in vitro bahwa tikus yang diperlakukan dengan CA makrofag yang diaktifkan menurut morfologi, biokimia dan kriteria molekuler, yaitu α5-β1 integrins, FC reseptor dan distribusi filamen α-aktin diubah dan penurunan produksi TNF. Produksi TNF lebih memainkan peranan penting dalam berbagai kondisi patologis, termasuk cachexia, syok septik, dan gangguan autoimun. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa penurunan TNF yang dirilis setelah dosis ulang CA, membenarkan sebagian perbaikan klinis dari banyak pasien. Pengujian kami menunjukkan bahwa kenaikan nitric oksida (NO) produksi yang disertai dengan deteksi peningkatan induksi aktivitas nitrat oksidase sintase (inos). Enzim ini ditemukan di sitoplasma terutama yang terletak di dekat vesikula dan mitokondria. NO dan jenis oksigen reaktif (ROS) diproduksi, di bawah berbagai kondisi-kondisi biologis dan mereka penting dalam pertahanan tuan rumah tidak hanya karena mereka dapat merusak sel-sel patogen dan tumoral tetapi juga karena mereka immunoregulator. Deteksi ultrastructural sitokimia dari aktivitas oksidase NADPH dilakukan dan dicirikan oleh endapan cerium lokal. Bagian ultratipis dari materi yang diamati tanpa pewarnaan, sehingga sinyal elektrodensitas adalah indikasi positif reaksi enzim. NADPH oksidase biasanya berada dalam makrofag, tetapi dengan cepat dapat diaktifkan oleh berbagai rangsangan. ketika fagosit diaktifkan, subunit sitosol bermigrasi ke membran, di mana mereka mengikat membran subunit terkait berkumpul oksidase aktif mengakibatkan pengiriman produk ke dalam vesikula dan lingkungan ekstraselular. Kelompok kontrol menunjukkan beberapa produk elektrodensitas pada beberapa makrofag yang diaktivasi. Canova, dalam beberapa cara, mengaktifkan jalur ini dalam sel-sel diamati, terutama di vesikula, produk reaksi positif kuat menunjukkan aktivitas oksidase NADPH.Peningkatan oksida nitrat sintase (inos), sehingga menghasilkan ROS dan NO masing-masing; menyebabkan penghambatan aktivitas oksidase sitokrom, sedangkan aktivitas Mg++ATPase dan AcPase  meningkat.

Akridin jeruk dan mikroskopi konfokal menunjukkan banyaknya vesikel asam pada mayoritas makrofag yang diberi Canova, dan juga telihat dalam jumlah banyak pada proyeksi sitoplasma. CA merangsang peningkatan endosomal/lisosomal sistem serupa dengan aktivitas fagosit pada makrofag ketika berinteraksi dengan Saccaromyces cerevisiae dan Trypanosoma cruzi pada fase epimastigot. Efek modulatory CA juga diamati secara in vivo dan in vitro dalam percobaan infeksi oleh Leishmania amazonesis dan Paracocodioides dengan cara mengontrol perkembangan infeksi dan membatasi penyebarannya. Selain itu tidak beracun dan mutagenik.

Hasil dengan perlakuan CA menunjukkan peningkatan resistansi terhadap infeksi dan benda asing serta terlihat kekebalan respon imunitas yang spesifik terhadap mikoorganisme melalui jalur fagositosis. Perlakuan ini mendorong perubahan morfologi makrofag, termasuk peningkatan daerah penyebaran mereka. Ini dapat menjadi kunci aktivitas untuk peningkatan kemampuan fagositosis pada bentuk non-infektif yang diamati. Sampai saat ini, beberapa pengubah respon biologis potensial yang dapat mengaktifkan makrofag telah dipelajari secara ekstensif. Canova, adalah pengobatan homeopati tanpa efek samping yang menyediakan alternatif yang baik untuk aktivitas makrofag. Evolusi pasien HIV/AIDS+ di Botswana dan Afrika telah dievaluasi pada studi prospektif. Partisipan dinilai melalui situs, Gabane Home Care, sebelum dan sesudah menyelesaikan satu dari delapan belas periode dari pengobatan Canova, menggunakan kuisoner pada penderita HIV/AIDS. Data yang diperoleh mengindikasikan bahwa pengobatan sangatlah efektif dalam mengurangi gejala dan meningkatkan kualitas hidup penderita HIV/AIDS dengan cara meyembuhkan parameter seperti, rasa sakit, nafsu makan, kemampuan untuk melakukan sedikit upaya dan kealpaan sosial. Evolusi pasien HIV/AIDS+ juga dievaluasi di Brazil, sebelum dan sesudah dari penggunaan Canova selama enam bulan. Pasien yang telah dinilai terhubung dengan Non Goverment Organization (NGO) dan Institusi kesehatan di Curitiba, Parana, Brazil. Pasien dievaluasi secara klinik di laboratorium dan mengikuti kuisoner kualitas spesifik hidup, dari The Measurement Grups. Data yang diperoleh mengindikasikan bahwa pegobatan efektif dalam mengurangi penyakit yang mungkin terjadi, meningkatkan banyaknya CD4 sel dan banyaknya eritrosit, dan meningkatkan parameter  pemulihankualitas hidup antara lain, mengurangi rasa sakit dan depresi, dan meningkatkan nafsu makan dan energi.

Kemajuan di respon imun pada tikus yang dilabeli Ca telah ditunjukan dalam pengamatan Sarkoma 180. Penurunan  pada ukuran sarkoma telah diamati dan infiltrasi yang signifikan dari sel limfoid, jaringan granula dan terjadi fibrosis di sekeliling tumor. Semua hewan yang telah dilabeli masih bertahan hidup, dan 30 % dari total regresi menunjukan adanya tumor. Perlakuan dengan Ca meningkatkan jumlah total leukosit. Diantaranya limfosit, T CD 4, B, dan sel NK yang meningkat. Hasil ini menyarankan aksi langsung atau tidak langsung dari Ca pada hematopoiesis. Jadi sel sumsum tulang belakang telah diamati dengan mikroskop cahaya, TEM dan SEM, dan mikroskop konfokal dan juga dengan sitometri alir. Semua tekhnik mikroskopi menunjukan bahwa garis keturunan monosit (CD 11b) dan sel stromal (sel pendukung) telah aktif oleh perlakuan. Canova juga meningkatkan grup sel lebih dari sel pendukung, di area proliferasidan diferensiasi.

Pengobatan CA sukses mengaktifasi mononuklear fagosit yaitu , monosit, jaringan makrofag, sel dendrit, mikroglia, dan osteoklas, adalah sel yang menjaga homeostasis jaringan dan menyediakan pertahanan utama melawan patogen.

1. 4. Kesimpulan

Hasil yang diperoleh adalah kebutuhan akan penelitian yang aman akan hubungan yang saling mempengaruhi antara obat homeopatik dan perlakuan makrofag pada virulan. Pengetahuan ini diperluas, kemampuan untuk menyeleksi pengaruh situs aktivasi makrofag diharapkan akan membawa kita untuk memanipulasi pengobatan ini pada penyakit yang berbahaya. Ini akan menjadi area penting untuk penelitian di kemudian hari, yaitu hubungan fungsional antara produksi sel imun oleh sitokin dan respon untuk perlakuan homeopati. Salah satu pencapaian yang sukses dari penelitian biologi adalah peningkatan yang tetap dari metode untuk memperoleh respon untuk pertanyaan yang tak terjawab. Ini terlihat jelas bahwa informasi yang dapat dipercaya tentang morfologi dan pengaturan dari sel dapat dipecahkan sebagian. Terlihat bahwa analisis sampel yang menggunakan teknik mikroskopi yang biasa  diterapkan pada kultur sel efisien untuk mempelajari mekanisme kerja obat.